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摘要: 研究黃芩對(duì) D-半乳糖致衰老模型大鼠的影響, 初步探討黃芩的抗衰老作用機(jī)制。將SD大鼠隨機(jī)分為5組, 即空白組、模型組、黃芩低、中、高劑量(分別為 50、100 和 200 mg·kg?1) 組, 采用皮下注射 D-半乳糖(100mg·kg?1)法, 建立亞急性衰老大鼠模型, 并分別評(píng)價(jià)衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力(Morris water maze)和自主活動(dòng)(open-field test)。采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)模型大鼠尿液進(jìn)行NMR數(shù)據(jù)采集并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析, 探討抗衰老機(jī)制。結(jié)果表明, 黃芩3個(gè)劑量均能改善衰老大鼠的行為能力。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, 黃芩低中高劑量組能使衰老大鼠尿液中檸檬酸、丙酮酸、乳酸、泛酸、三甲胺和β-羥基丁酸等6個(gè)標(biāo)志物發(fā)生不同程度的回調(diào), 主要涉及能量代謝、糖代謝和腸菌代謝等代謝途徑的調(diào)節(jié),表明黃芩發(fā)揮抗衰老作用與這些途徑相關(guān)。
衰老是機(jī)體組織、器官功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的退行性變化,是基因、環(huán)境和生活方式等多種因素共同作用的結(jié)果。隨著年齡增長(zhǎng),一些疾病例如阿爾茨海默癥、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和癌癥等發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)明顯增加。具有抗衰老活性的天然產(chǎn)物如中藥和植物藥的應(yīng)用日益廣泛, 這對(duì)于抗衰老知識(shí)的積累具有重要意義。
代謝組學(xué)是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法,可通過(guò)揭示新陳代謝動(dòng)態(tài)進(jìn)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,全面理解病理變化過(guò)程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑。目前,基于核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為一種強(qiáng)有力的工具,廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)、分子病理學(xué)、臨床診斷、生物醫(yī)藥和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。由于衰老過(guò)程的復(fù)雜性,目前對(duì)于衰老的發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚。近年來(lái),包括代謝組學(xué)技術(shù)在內(nèi)的高通量技術(shù)的應(yīng)用,為衰老的病理生理學(xué)機(jī)制提供了新的解釋,并且可以在不同物種中鑒定與衰老相關(guān)的特異標(biāo)志物。
D-半乳糖致衰老模型目前應(yīng)用最多,該模型具有壽命縮短、學(xué)習(xí)記憶障礙、神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變、免疫力和繁殖力低下等多種衰老表現(xiàn),在多種器官組織形態(tài)及生理生化的許多指標(biāo)上呈現(xiàn)出與自然衰老相似的改變,廣泛用于衰老機(jī)制研究及抗氧化劑、延緩衰老藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。許多研究表明, D-半乳糖致衰老大鼠的自發(fā)行為(曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)) 會(huì)減少,空間記憶能力也會(huì)有損傷(水迷宮實(shí)驗(yàn))。
本文擬采用D-半乳糖致衰老大鼠模型, 通過(guò)行為學(xué)考察,驗(yàn)證黃芩的抗衰老作用, 采用基于1HNMR的代謝組學(xué)方法對(duì)大鼠尿液代謝物的變化進(jìn)行測(cè)定分析,初步闡明黃芩延緩衰老的作用機(jī)制, 為黃芩的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。
材料與方法
藥材 黃芩藥材購(gòu)自山西陵川縣六泉中藥材合作社,由山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi) 的干燥根, 樣品保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。
動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠, 體重(180±20) g, 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (京) 2012-0001;動(dòng)物飼養(yǎng)室保持溫度(23±1.5)℃,相對(duì)濕度(45±15)%。動(dòng)物適應(yīng) 1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
儀器與試劑 Bruker 600-MHz AVANCE III 核磁共振檢測(cè)儀(德國(guó)布魯克公司); Sartorius BSA124S 分析天平(德國(guó) Sartorius 公司); Morris 水迷宮(上海欣軟公司)；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱（上海欣軟公司）。HPLC分析用甲醇為色譜(Fisher公司); D-半乳糖(Amresco公司),三甲基硅烷丙酸鈉鹽(TSP, Cambridge Isotope Laboratories Inc., MA), NMR 試劑重水(Norell, Landisville, USA), 娃哈哈純凈水。
黃芩提取物制備方法 取黃芩粉末20g,分別用10 倍量的60%乙醇和蒸餾水作溶劑回流提取 2 次, 每次2h,合并兩次提取液,減壓回收溶劑,冷凍干燥得粉末。分別取黃芩水提物和醇提物適量,按照藥典方法測(cè)定黃芩苷的含量,以其含量的高低作為溶劑選擇的依據(jù)。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雄性SD 大鼠 50 只,隨機(jī)分為空白組,模型組,黃芩低、中、高劑量組,每組10只。模型組與黃芩低、中、高劑量組每天皮下注射D-半乳糖 100 mg·kg?1,連續(xù) 10 周,空白組注射等體積的生理鹽水。黃芩低、中、高劑量組每天分別按劑量50、100 和 200 mg·kg?1灌胃給藥, 空白組與模型組每天灌胃等體積的蒸餾水,連續(xù)10 周。
行為學(xué)考察
曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)于造模第10 周進(jìn)行,將大鼠放入曠場(chǎng)行為測(cè)試箱的中心位置,適應(yīng) 2min后,觀察 4min 內(nèi)大鼠的直立次數(shù)、靜止時(shí)間和穿越格數(shù)。
Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,開(kāi)始 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。采用XR-XM101型Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試,實(shí)驗(yàn)器材由圓形水池和自動(dòng)錄像分析系統(tǒng)兩部分組成。圓形水池由ABS制成,直徑160 cm,高 50 cm。水池被等分為4 個(gè)象限, 水深30cm,平臺(tái)位于任一象限的中間,且表面低于水面l～2 cm。水溫保持在25℃左右。池上方的攝像機(jī)同步記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。經(jīng)Supermaze軟件分析處理, 得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。水迷宮實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求安靜,避免一切外界干擾,保持房間安靜,溫度適宜,光線柔和,實(shí)驗(yàn)期間迷宮外的參照物始終保持不變以供大鼠定位。
實(shí)驗(yàn)程序參照Morris等的方法進(jìn)行,測(cè)試包括: ① 定位航行實(shí)驗(yàn), 用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力,即記錄其潛伏期。歷時(shí)5 天,訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)象限將大鼠面向池壁放入水中, 迫使大鼠學(xué)習(xí)尋找設(shè)于水面以下的平臺(tái)。電腦中記錄 60 s 內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間即潛伏期。如果60 s 內(nèi)未能找到平臺(tái),可將其引導(dǎo)至平臺(tái)并在平臺(tái)停留 20 s, 潛伏期記錄為 60 s。每天訓(xùn)練 4 次,每次訓(xùn)練間隔10 min。系統(tǒng)自動(dòng)記錄多項(xiàng)參數(shù); ② 空間探索實(shí)驗(yàn), 用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后,對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤去平臺(tái),將大鼠面向池壁任選一個(gè)入水點(diǎn)放入水中,可以記錄60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)及在目標(biāo)象限的活動(dòng)路程和活動(dòng)時(shí)間并進(jìn)行比較分析。數(shù)據(jù)收集和處理由Morris水迷宮系統(tǒng)軟件完成。
樣品采集與制備及測(cè)定條件 尿樣采集與儲(chǔ)存: 所有大鼠于第10周末晚上 18:00 至第二天早上 8:00放入代謝籠,冰上收集尿液, 12 000 r·min?1離心,取上清液,于?80℃儲(chǔ)存。
樣品前處理: 解凍樣品,搖勻, 在4 ℃下12000 r·min?1離心 10 min,取尿液0.4 m L,置于核磁管,加PBS (p H 7.0) 0.2 m L, 再加入 D2O 0.1 m L,放置 10 min, 進(jìn)行核磁測(cè)定。
樣品于 600 MHz NMR(25 ℃)儀上測(cè)定,采用NOE-2DSpectroscopy (NOSEY)脈沖序列。測(cè)定頻率為600.13 MHz,掃描次數(shù)為64,譜寬12345.7 Hz,脈沖時(shí)間14 s,采樣時(shí)間2.654 s,延遲時(shí)間1.0 s,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536, FID 分辨率0.188 Hz,采樣間隔40.5 s,內(nèi)標(biāo)為TSP。
1HNMR 譜圖數(shù)據(jù)處理與分析 核磁圖譜采用Mest Re Nova (version 8.0.1, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, 西班牙) 進(jìn)行處理。所有光譜進(jìn)行手動(dòng)相位、基線調(diào)整。圖譜中,以TSP的化學(xué)位移δ 0.00為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定標(biāo),以δ 0.04對(duì)化學(xué)位移區(qū)間 δ0.00～9.40進(jìn)行分段積分,其中 δ 4.60～5.00 (殘余水峰,尿素峰) 不進(jìn)行積分,并將積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,導(dǎo)入Excel軟件中進(jìn)行下一步多元統(tǒng)計(jì)分析。將上述處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P13.0(Umetrics, Sweden)軟件中進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA),再用偏最小二乘法判別分析 (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal PLS-DA, OPLS-DA)找出樣品間差異代謝產(chǎn)物。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件處理,以x ±s 表示,采用單因素方差分析及t 檢驗(yàn)對(duì)行為學(xué)指標(biāo)及差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較,以 P< 0.05, P<0.01 為差異具有顯著性。
討論
本研究復(fù)制了衰老模型,使大鼠明顯出現(xiàn)了以學(xué)習(xí)記憶能力下降為主要表現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙。
尿液是機(jī)體整體代謝終產(chǎn)物輸出的主要途徑之一, 尿液中代謝物的變化不僅能夠反映機(jī)體整體代謝的特征,還可能是局部組織或器官功能異常的外在表現(xiàn)。本研究采用1H NMR分析手段檢測(cè)出20多種尿液中代謝產(chǎn)物,主要包括脂肪酸類、氨基酸類和有機(jī)酸類等代謝產(chǎn)物。
本研究進(jìn)行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),檸檬酸、乳酸、泛酸、三甲胺、α-酮戊二酸、丙酮酸、β-羥基異戊酸和β-羥基丁酸受D-半乳糖影響較大,可能為D-半乳糖致衰老模型的潛在生物標(biāo)志物。給予黃芩干預(yù)后,檸檬酸、乳酸、泛酸、丙酮酸、三甲胺和β-羥基丁酸有不同程度的回調(diào), 其中以黃芩高劑量效果最為顯著。
通過(guò)對(duì)潛在生物標(biāo)志物分析,發(fā)現(xiàn)黃芩延緩衰老主要涉及兩條代謝路徑: 三羧酸(TCA)循環(huán)和丙酮酸代謝。TCA循環(huán)產(chǎn)生的ATP 是組織細(xì)胞能利用的主要能源來(lái)源,在這一過(guò)程中產(chǎn)生的ATP 都是經(jīng)由呼吸鏈產(chǎn)生的,模型組中 TCA 循環(huán)的中間體檸檬酸和 α-酮戊二酸均降低, 說(shuō)明機(jī)體衰老也使得TCA能量代謝水平降低,其中間代謝物水平也相應(yīng)降低。研究表明,如果與能量代謝相關(guān)的基因下調(diào)會(huì)造成能量產(chǎn)生減少,損傷ATP依賴的下游過(guò)程,如突觸結(jié)構(gòu)和功能的完整,泛素依賴的蛋白降解途徑,而這兩者都在阿爾茨海默癥(AD)中受影響。
丙酮酸是體內(nèi)產(chǎn)生的三碳酮酸,在三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。丙酮酸的變化對(duì)于評(píng)價(jià)體內(nèi)炎癥發(fā)生有重要的作用。在炎癥時(shí),即使有氧條件下機(jī)體優(yōu)先進(jìn)行丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的代謝, 這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或Warburg 效應(yīng)。丙酮酸的變化與糖酵解及TCA 循環(huán)等密切相關(guān)。D-半乳糖刺激時(shí),丙酮酸明顯增加,其原因是糖酵解和TCA 循環(huán)發(fā)生障礙。黃芩可以降低尿液中丙酮酸的含量,使糖酵解和TCA 循環(huán)代謝恢復(fù)。
丙酮酸代謝和TCA循環(huán)都發(fā)生在線粒體內(nèi),這就提示黃芩可能通過(guò)代謝路徑的調(diào)節(jié)促進(jìn)線粒體呼吸,保護(hù)線粒體功能,最終與延緩衰老有關(guān)。線粒體廣泛分布于各種真核細(xì)胞內(nèi),是進(jìn)行氧化代謝的部位,是糖類、脂肪和氨基酸代謝釋放能量的場(chǎng)所。除為細(xì)胞活動(dòng)提供能量外, 線粒體還參與一些重要代謝通路,參與細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控等生化功能,大量實(shí)驗(yàn)研究表明線粒體在衰老進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
與空白組相比,模型組中乳酸含量升高。在認(rèn)知嚴(yán)重?fù)p傷的犬和早發(fā)性AD患者中也出現(xiàn)類似的結(jié)果,乳酸含量是正常組的4 倍。乳酸水平的升高不僅說(shuō)明糖異生、碳水化合物和能量代謝發(fā)生變化,還說(shuō)明腦中糖代謝損傷,這是造成認(rèn)知損傷的一部分原因。此結(jié)果與行為學(xué)結(jié)果吻合。
三甲胺是由膽堿和肉堿在腸道細(xì)菌酶作用下的降解產(chǎn)物,腸道菌群代謝的改變與衰老相關(guān)的疾病有關(guān)。模型組三甲胺含量升高,表明隨著年齡的增長(zhǎng),腸道菌群代謝會(huì)發(fā)生紊亂。而黃芩高劑量可以降低三甲胺含量,說(shuō)明黃芩發(fā)揮抗衰老作用與調(diào)節(jié)腸道菌群的正常代謝有關(guān)。
本研究結(jié)果表明,黃芩對(duì)衰老大鼠的記憶損傷及自發(fā)行為的下降均有改善,黃芩延緩衰老的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)能量代謝、糖代謝和腸菌代謝等代謝途徑有關(guān)。
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