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熒光定量PCR儀如何選擇?

2019-12-11瀏覽量:2881編輯:來源:

實(shí)時熒光定量pcr儀,由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成,用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?;幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?;罂梢栽O(shè)定域值水平,這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。

朗基熒光定量PCR儀


那如何選擇熒光定量PCR儀器呢,可以從以下幾個方面著手:

1、儀器使用的廣泛程度

  如果不是一個新出現(xiàn)的儀器品牌,為保證所購置的儀器有充分的可靠性,臨床PCR實(shí)驗(yàn)室可以從相應(yīng)儀器在國內(nèi)外使用的廣泛程度來判斷。應(yīng)用越是廣泛的儀器,越是經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證的,也就越具有可靠性。
2、儀器的檢測通量(反應(yīng)孔數(shù))
  在購買定量PCR儀的時候需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的要求來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR儀的檢測通量小到16多到384孔,實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的檢測項(xiàng)目和發(fā)展?fàn)顩r,選擇合適的儀器,沒必要追求最昂貴的儀器,一般來說,96孔的通量足夠用了;如需尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記等類型的實(shí)驗(yàn),則可以考慮購買384孔的儀器。
3、儀器的通道數(shù)量
  隨著醫(yī)院開展的項(xiàng)目越來越多,比如基因表達(dá),單核苷酸多態(tài)性分析、高分辨率熔解曲線等,那么單通道的儀器則無法滿足實(shí)驗(yàn)室的需求了,而多通道的設(shè)計(jì)則能使其更方便地檢測多重PCR檢測及其衍生的基因表達(dá)等其他分析模式。
4、耗材的開放性
  耗材如擴(kuò)增反應(yīng)管的開放性可能會決定日常檢測成本的高低。作為臨床PCR實(shí)驗(yàn)室,在選擇實(shí)時熒光PCR儀時,可考慮這一點(diǎn)。不過對于檢測HCV等RNA項(xiàng)目的時候,盡量使用去RNAnase酶耗材。
5、硬件設(shè)計(jì)特點(diǎn)
  熒光定量PCR儀主要有96孔板式和離心式等,每種設(shè)計(jì)都有它的獨(dú)到之處,但也都有無法避免的缺陷。
  96孔板的熒光定量PCR儀可以容納的樣本量大,最大可至100ul,而且無需特殊的耗材。傳統(tǒng)的96孔板儀器多采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測。其優(yōu)點(diǎn)在于:鹵鎢燈的光強(qiáng)比LED燈強(qiáng),波長范圍廣,對于熒光染料的激發(fā)具有非常好的效果,性能比較穩(wěn)定,使用壽命約3000個小時左右;但CCD的檢測通常會因?yàn)槊總€樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同,會產(chǎn)生邊緣效應(yīng),對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。為了保證精確、精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常需要配合ROX校正染料,來平衡孔間差異;
離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測,設(shè)計(jì)上避免了邊緣效應(yīng),同時PMT檢測對熒光信號可以放大或縮小,相對于CCD檢測更加靈活,靈敏度更高;但LED的熒光強(qiáng)度比較弱,波長范圍也比較窄,因此,對熒光染料的激發(fā)效果不如鹵鎢燈;
6、運(yùn)行速度
  在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中,升降溫速度也是非常重要的。更快的升降溫,可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時間,而且縮短了可能的非特異性結(jié)合和反應(yīng)時間,提高PCR的特異性。但是,運(yùn)行速度越快,對加熱制冷模塊的要求越高,因此,穩(wěn)定性是其存在的最大問題,如果在市面上經(jīng)過長期考證的,穩(wěn)定性好的儀器,運(yùn)行速度越快,帶來的便捷越多;
7、靈活性

  在儀器基本性能得到保證的情況下,另外一方面則需要考慮儀器的靈活性,主要包括:儀器運(yùn)輸?shù)撵`活性,拆卸的靈活性,軟件升級的靈活性,模塊更換的靈活性以及使用的靈活性等。



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