流式細胞術的樣品制備

流式細胞術的實驗檢測對象是單細胞懸液，因此需把樣品制備成細胞懸液，細胞濃度為10⁵～10⁷個／ml。制備成的單細胞懸液經熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。

樣本制備的基本原則：1.使各種液體和懸浮細胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測；2.針對不同的細胞樣本進行適當洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質，使粘附的細胞彼此分離而形成單細胞狀態(tài)；3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯用酶消化法，機械打散法和化學分散法來獲得足夠數量的單細胞懸液；4.對石蠟包埋組織應先切成若干40-50μm厚的蠟片，經二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細胞懸液；5.單細胞懸液的細胞數不應少于10⁷個/ml。

 一、新鮮實體組織樣本的制備

 （一）酶處理法  此法是實體組織分散為單個細胞的主要方法。由于不同酶對細胞內和細胞間不同組分有特異消化作用，所以應根據所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能結合組織中的二價鈣離子和鎂離子，而二價鈣離子和鎂離子有維持細胞表面完整性和維持細胞間質結構的作用，因此，幾種酶和EDTA聯合使用有助于充分消化實體組織，提高細胞產出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程，對于每種組織消化時所用的具體步驟需參考該組織細胞培養(yǎng)時的消化方法。

1．將組織剪成l～2mm3左右的小塊。

2．用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0．1％～0．5％。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0．25％膠原酶，膠原酶對組織中膠原蛋白類結構消化作用強，它僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。膠原酶常用劑量為0．1～0．3ug／ml。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織，需每隔一定時間搖動一次。消化時間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶需作用20～60分鐘，膠原酶需4～48小時。在消化過程中，如發(fā)現組織塊已分散而失去塊的形狀，經搖動即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個細胞和少量的細胞團，可認為組織已消化充分。

3．消化完畢后，將細胞懸液通過100目孔徑尼龍網或不銹鋼網濾過，以除掉未充分消化的組織。

4．已過濾的細胞懸液經800～1000rpm低速離心5～10分鐘后，棄上清液，加PBS液，輕輕吹打形成細胞懸液，細胞計數后即可使用。

（二）機械法  機械法分散實體組織，用手術剪刀剪碎組織、用鋒利的解剖刀剁碎組織或用勻漿器制成組織勻漿，再用細注射針頭抽吸細胞或用300目尼龍網濾除單細胞懸液；采用網搓法也能獲得大量細胞。機械法易造成細胞碎片和細胞團塊，所以常與其他方法配合使用。

1．剪碎法

（1）將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；

（2）用剪刀將組織剪至勻漿狀；

（3）加入10ml生理鹽水；

（4）用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網過濾到試管中；

（5）離心沉淀1000r/min，4~5min，再用生理鹽水洗3遍，每次以低速（500~800r/min）短時離心沉淀去除細胞碎片。

（6）以300目尼龍網濾去細胞團塊；

（7）細胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>

2．網搓法

（1）將100目、300目尼龍網扎在小燒杯上；

（2）把剪碎的組織放在網上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完；

（3）收集細胞懸液，500~800r/min離心沉淀2min；

（4）固定細胞或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>

3．研磨法

（1）先將組織剪成1~2mm2 大小組織塊；

（2）放入組織研磨器中加入1~2ml生理鹽水；

（3）轉動研棒，研至勻漿。

（4）加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器；

（5）收集細胞懸液，并經300目尼龍網過濾，離心沉淀500~800r/min，1~2min，再以生理鹽水水洗3遍，離心沉淀；

（6）固定或低溫保存細胞懸液，備用。

二、組織活檢、內鏡取材標本單細胞懸液的制備

正常組織、瘤組織和淋巴結等活檢組織以及內鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標本，由于材料較少、制備起來比較麻煩，但其制備方法與實體組織基本相似。

1．取材后立即放入盛有少許PBS液的青霉素小瓶中；

2．另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網蓋住，用線繩固定好，并用PBS液濕潤；取新鮮組織標本置尼龍網上，因標本量少，尤其是內鏡取材至少要取3塊以上。

3．在操作前，先將剪刀用PBS液浸潤一下，然后開始剪碎組織；

4．先剪幾下，視基本無組織塊存在時，用原來裝標本的青霉素小瓶中的PBS液，沖洗細胞勻漿并過濾于小燒杯中，如果這時仍有可見組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該PBS液沖洗，直至網上無組織塊為止。這樣可盡量多地收集細胞。

5．細胞加固定液或低溫保存，備用。

三、石蠟包埋組織的流式細胞樣品制備 

外科手術獲得的新鮮實體組織，往往已進行石蠟包埋處理。石蠟包埋組織單細胞分散方法的建立，擴大了流式細胞術的應用范圍。

1．把石蠟包埋組織切成10~50um厚的組織片3~5片，或用乳缽研成0.5mm直徑大小顆粒狀，放入10ml的試管中；

2．加入二甲苯5~8ml，在室溫下脫蠟1~2天，視石蠟脫凈與否，更換1~2次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯；

3．水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步為10min，去乙醇，加入蒸餾水3~5ml，10min后棄之；

4．消化：加入2ml 0.5%胰蛋白酶（pH 1.5~2.0）消化液，置37℃恒溫水浴中消化30min，在消化期間，沒隔10min用振蕩器振蕩1次；

5．消化30min后，立即加生理鹽水終止消化；

6．經300目尼龍網過濾，未消化好的組織可做第二次消化；

7．收集細胞懸液，離心沉淀1500r/min，再以生理鹽水洗滌1~2次，離心沉淀500~800r/min，去碎片；

8．保存細胞備用。

四、外周血單個核細胞的制備

1．取外周血2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成4ml，混勻；

2．將稀釋后的血液沿試管壁徐徐加入4ml淋巴細胞分離液ficoll到液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰地分層狀態(tài)；

3．離心2000r/min，30min，室溫18~20℃，離心后可見試管內的血液清楚地分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層（單個核細胞處于血漿層和分離液層中間），底層為紅細胞層，紅細胞層上為粒細胞層；

4．用吸管將上層與中層之間的單個核細胞層吸出收集到另1試管中，用生理鹽水洗2遍，每次均以1500r/min，離心10min，棄上清后即得到高純度的單個核細胞懸液；

5．用適當的固定液固定或置低溫冰箱保存待用。

五、骨髓細胞單細胞懸液的制備

1．無菌抽取骨髓液0.5ml;

2．將骨髓標本滴入含1000U/ml肝素抗凝劑的1ml PBS液中；

3．再加入PBS液稀釋至10ml；

4．用吸管吸取5ml稀釋骨髓液徐徐加入盛有4ml的人類淋巴細胞分離液液面之上；

5．以上條件下，骨髓有核細胞分層在PBS-人類淋巴細胞分離液之間形成的界面上；

6．取有核細胞層，加入到10ml PBS液中，混勻；

7．以1000r/min離心5min，棄上清，收集骨髓細胞，加固定液或置低溫冰箱備用。

六、單層培養(yǎng)細胞單細胞懸液的制備

1．棄去培養(yǎng)細胞(對數生長期)中的舊培養(yǎng)液，加入1～2ml 0．25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶，靜置消化2～3分鐘，待細胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養(yǎng)瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；

2．加入3～4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液，用吸管反復吹打，使其分散為單個細胞懸液，移人離心管中；

3．短時低速離心，即800~1000r/min，離心5min；

4．去掉上清液，加入5~8ml PBS液，低速短時離心，800~1000r/min，離心3~5min；重復2~3次，以去除細胞懸液中的細胞碎片。

5．加少許PBS液，將沉淀細胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。

七、脫落細胞單細胞懸液的制備

在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細胞，這些細胞標本經過簡單處理，便可成為較好的單細胞懸液供流式細胞術分析。主要包括脫落細胞、胸腹水細胞、尿液、內鏡刷檢細胞等。

（一）食管拉網細胞的單細胞懸液的制備

1．將食管拉網器上的細胞洗脫到20ml PBS液中，以1500r/min離心后，再用PBS液洗2次，離心500~800r/min，1~2min，棄上清；

2．再加入PBS液5ml，以300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

3．加少許PBS液混勻沉淀細胞，加固定液或低溫保存，備用。

（二）尿液脫落細胞的單細胞懸液的制備

1．用以清潔器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，輕輕倒去上清液，留下少許帶細胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml離心管中；

2．500r/min離心10min，去上清；

3．加PBS液8~10ml，以1000r/min離心10min，去上清，重復再洗1次；

4．再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

5．再加少許PBS液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。

（三）胸、腹水脫落細胞的制備

1．抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放鹽水瓶中置于4℃冰箱中靜置6~12h，棄去上清；

2．將底部10~20ml用長吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min；

3．再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

4．加少許PBS液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。

（四）沖洗液細胞樣品的制備

1．用300~500ml生理鹽水沖洗膀胱，沖洗一定時間后，吸出沖洗液放入容器中于冰箱內置6~12h；

2．取沉淀液20~40ml，離心沉淀并以生理鹽水洗2次，吸上清；

3．加10ml PBS液，混勻，以300目尼龍濾網過濾，離心沉淀去上清；

4．過濾后1000r/min，10min，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>